EasyMut基因多点突变试剂盒

产品信息：

产品储存：请按产品指示温度保存各成分

产品介绍：

本产品利用无缝克隆技术来实现基因的定点突变，可用于单点突变和多点突变质粒的构建。本产品无需除去甲基化模板质粒，无需PCR扩增出整个质粒，并且引物设计更加简便快速，因此可以更加快速，高效地实现定点突变。

产品特点：

1.利用2×Xerox PCR Master Mix扩增片段，缩短扩增时间（2-4 kb/min），提高保真性；

2.引物设计更加简单，快速；

3.省略消化甲基化模板质粒的步骤，更加快速，高效；

4.无需PCR扩增出整个质粒，减少载体的突变。

实验原理：

实验步骤：

一、突变位点的引物设计

1.突变位点引物设计要求 ：

（1）在每个突变位点处需设计一对引物，且突变位点在重叠区约中部位置。可以先设计正向引物，然后通过反向互补得到反向引物。

（2）引物的长度通常为30-40个碱基，突变位点两侧的碱基数在15-20个左右，GC%含量在40%-60%为最佳。

（3）避免引物末端为重复序列。

2. 引物设计示例：

（1）单点突变引物设计：如图1

图1

（2）多点突变引物设计：如图2

图2

二、突变片段的制备

1.PCR扩增

（1）PCR扩增体系

（2）PCR扩增条件

注意：为了获得更高保真性的扩增产物，采用高浓度模板和少量PCR循环数组合的扩增方法。

2.纯化片段

（1）电泳检测：取10 μl PCR产物，根据片段大小选择合适浓度的琼脂糖凝胶电泳检测。

（2）如果扩增片段单一，建议用PCR产物纯化回收试剂盒纯化片段；如果有非特异扩增，建议使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂回收片段。

三、线性化载体的制备

可以通过酶切或PCR扩增的方法来制备线性化载体，且最好使用空载体质粒进行酶切或PCR扩增。

1.酶切获得线性化载体

利用单酶切或双酶切对空载体进行线性化处理，一般双酶切比单酶切线性化效果好。载体的完全线性化是无缝连接成功的关键。单酶切或双酶切方式制备的线性化载体无需进行末端脱磷酸化处理。通过电泳方法判定载体线性化是否完全时，一定要用未酶切的质粒做对照一起电泳。酶切完成后建议采用胶回收方法纯化线性化载体。

2.PCR扩增制备线性化载体

以空载体质粒为模板，设计一对引物用高保真DNA聚合酶（如Xerox）扩增，制备用于重组的线性化载体。为防止残留环状载体质粒对克隆阳性率的影响，可以采用胶回收方法或者Dpn I消化结合胶回收的方法纯化线性化载体。

四、突变片段与线性化载体的重组连接

连接体系：

轻轻混合，50℃反应15 min（2-3个片段，15 min；4个片段以上，60 min），反应完成后，将离心管放在冰上数秒。

连接产物可直接用于转化或放于-20℃保存。

五、转化

1.从-80℃冰箱中拿出感受态细胞，放于冰上溶解；

2.取5-10 μl连接产物加入到刚化冻的50μl或100 μl感受态细胞中，轻轻混匀；

3.冰上静置20-30 min；

4.42℃，热击90 sec；

5.冰上放置2 min；

6.加入900 μl无抗性的LB液体培养基，200 rpm，37℃，培养60 min；

7.4000 rpm 离心1 min，弃掉部分上清，保留100-200μl，用吸头吹打悬浮菌体，取100μl菌液涂在相应抗性板上，37℃倒置培养过夜。

六、阳性克隆鉴定

1.菌落PCR方法；

2.限制性酶切分析方法；

3.DNA测序方法

常见问题及解决方法：

1.转化后没有克隆或克隆数少

（1）感受态细胞效率降低，请用pUC19检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在

108cfu/μg以上。

（2）PCR扩增的突变片段产物进行胶回收纯化，确定其条带的大小和单一性。

2.转化后菌落有很多空载体质粒

这种情况主要是由于线性化载体制备不好造成的。鉴定一下质粒的质量，保证质粒完全酶切。如果内切酶无效也会产生这种现象。

3.测序没有信号

（1）检查送测序的质粒和原始质粒酶切后是否大小完全一致 。

（2）用测序引物对原始质粒测序，验证测序引物的有效性。

猜你喜欢